女性阴道自采样本检测PAX1/JAM3双基因甲基化标志物作为子宫颈癌筛查的可行性评估

方法 单中心横断面研究。2023年1—11月在阴道镜门诊同时收集女性自采样本及医生采样样本，分别进行PAX1/JAM3双基因甲基化（PAX1 m/JAM3 m）检测，以组织病理学为标准。总计招募301例接受阴道镜检查女性，并对272例有组织病理与检测信息的女性进行统计分析。通过Spearman相关性分析和χ²检验比较两种采样方法PAX1 m/JAM3 m检测结果的一致性。通过计算受试者操作特征曲线（ROC）和曲线下面积（AUC）比较女性自采样本甲基化检测与现行临床检测及其组合方法在临床研究中用于子宫颈癌筛查的效益

结果 在所有招募的受试者中，正常子宫颈组织或慢性子宫颈炎102例（37.5%）、子宫颈上皮内瘤变1级（CIN1）72例（26.4%）、CIN2 43例（15.8%）、CIN3 29例（10.7%）、子宫颈癌26例（9.6%）。按最低检出量公式计算区分成为81例一致性研究组和191例临床研究组。Spearman相关性分析表明，自采样本和医生采样样本进行PAX1和JAM3双基因甲基化检测结果的卡氏评分呈正相关（ r\=0.858、0.828， P均 对象与方法 一、对象 2023年1—11月在南华大学附属第一医院妇科阴道镜门诊招募受试者，在医院进行本研究。所有受试者均签署知情同意书，该研究获得南华大学附属第一医院伦理委员会批准［医伦审2021第（yz2021104）号］。 纳入标准：（1）女性年龄大于18岁并有性生活史；（2）均接受细胞学、hrHPV检查且转诊阴道镜；（3）病历资料完整；（4）完成知情同意书签署。 排除标准：（1）月经期、妊娠期或哺乳期；（2）已知生殖道恶性肿瘤或其他肿瘤史；（3）3 d内有性生活、阴道冲洗与阴道用药；（4）6个月内接受宫颈或阴道病变治疗者；（5）有自身免疫性疾病史，或正在服用免疫抑制剂；（6）HPV疫苗接种史；（7）退出研究与临床资料不完整者。 研究共招募了301例患者，其中29例患者因无活检病理、无法自行采检或甲基化检测失败等被排除。共计272例患者被纳入本研究统计分析，其中未绝经患者占72.4%（197例），绝经患者占27.6%（75例）；87.1%的患者为hrHPV阳性，59.6%的患者细胞学诊断为未明确诊断意义的不典型鳞状细胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS）。组织病理提示，宫颈良性或慢性子宫颈炎（正常）、CIN1、CIN2、CIN3和子宫颈癌分别为102例（37.4%）、72例（26.5%）、43例（15.8%）、29例（10.7%）和26例（9.6%），其中一致性研究组共81例，年龄41.0（34.0~48.0）岁；验证研究组191例，年龄37.0（29.0~47.0）岁。二组受试者实际入组例数均大于有效评估指标例数。 本研究包含：（1）一致性研究：同一受试者阴道自采与医生采样本进行PAX1 m/JAM3 m 检测，探讨自采样本进行双基因甲基化检测结果是否与医生采样检测结果一致；（2）临床研究：以病理为金标准，将自采样本PAX1 m/JAM3 m检测结果与HPV及细胞学检测结果进行比对，进行不同临床检测方法的效益分析；（3）临床研究：自采样本进行PAX1 m/JAM3 m检测在绝经前与绝经后女性临床的检测性能分析。 二、方法 1\. 试剂与仪器：人高危型（14型）人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）购自广州凯普生物公司；一次性宫颈脱落细胞采样器购自江苏健友医疗科技有限公司；（宫颈）细胞保存液体购自慈达生物技术有限公司；人PAX1和JAM3基因甲基化检测试剂盒（PCR-荧光探针法）购自北京起源聚禾生物科技公司；SLAN-96S全自动医用PCR分析系统购自上海宏石医疗科技有限公司。 2\. 一致性样本量估算：受试者自采与医生采集样本二组数据之间的非劣效性试验样本量估计基于RMLE法 ［  13 , 14 ］ 。 根据经验CIN2及以上病变（CIN2+）样本量预估参数设定为：（1）自采和医生采样本检测双基因甲基化在CIN2+中的敏感度为90%，2种采样方式结果均为阳性的占89%，均为阴性的占9%，则 P 01\=0.089；（2）非劣效性单侧检验水准α=0.05；（3）把握度为80%，则β=0.2；（4）非劣效界值为δ=0.15。按照配对二项数据非劣效性检验基于RMLE方法估算，需要纳入34例以上CIN2+病例。由医生依据CIN2+与CIN2-人数收集研究对象。 3\. 临床研究样本量估算：（1）受试者的选择及样本量计算。研究假设：目标受试者自采样本与医生采样本PAX1 m/JAM3 m检测的有效率一致。 样本量估计CIN2+参数设定为：自采样敏感度=90%；置信水平=0.95，α=0.05；（3）L=0.1。按照式（1）计算，计算公式如下。 其中L为95% CI宽度的一半。 由公式（1）计算结果得知需要招募35例以上CIN2+受试者即可满足本研究最低人数要求。 对于CIN2-样本量估计参数设定为：自采样特异度=90%；置信水平=0.95，α=0.05；L=0.05。按照式（1）计算结果得知需要招募139例 4.样本采集流程：本研究纳入妇科门诊宫颈细胞学检测≥ASCUS或hrHPV检测阳性患者样本。保留拟入组患者宫颈细胞学检测或者HPV检测样本（医生采集样本），并嘱患者阴道镜检查前签署知情同意书，后实行患者自采样过程并保留样本。医生采集样本与患者自采样本分别进行PAX1/JAM3基因甲基化检测，并应用于一致性研究和对比不同检测临床性能的研究中。 5\. 宫颈细胞学与HPV检查：在阴道镜检前，患者暴露宫颈后，医生用无菌大头棉签轻轻擦拭宫颈表面分泌物，用宫颈脱落细胞取材刷于宫颈表面及宫颈管内顺时针旋转5周获得宫颈脱落细胞，并将刷头放入细胞保存液瓶后贴好检测条形码，可室温保存6个月。样本经处理后将脱落细胞制片、染色。由细胞病理医生依照2014年修订的宫颈细胞学结果分级系统（the Bethesda System，TBS）进行描述并诊断。取2 ml样本提取DNA后在聚合酶链反应仪对hrHPV进行扩增检测。部分受试者的自采与医生采样本作为PAX1 m/JAM3 m检测一致性比对使用。 6\. 自采样本：受试者持一次性宫颈脱落细胞采样器，将采样器伸入阴道并顶到采样器垫片后，以顺时针方向旋转5~10 周，将采样器刷头依照折线处折断后放入（宫颈）细胞保存液中，可室温保存6个月。 7\. DNA甲基化检测：取自采样本细胞保存液瓶（6个月内）1 ml样本，进行DNA提取纯化，并进行DNA浓度和质量测定。取200~1 000 ng DNA进行重亚硫酸盐转化。重亚硫酸盐转化后DNA在SLAN-96S全自动医用PCR分析系统进行扩增检测，每次检测时加入阳性与阴性对照品。反应结束后根据PAX1基因、JAM3基因与内参基因（GAPDH）的Ct值，计算ΔCt（ΔCt=Ct检测基因-Ct内参基因），使用内参基因CtGAPDH 8\. 阴道镜检查及宫颈活检：患者取截石位放置窥阴镜，充分暴露宫颈，使用生理盐水冲洗宫颈表面黏液，观察宫颈的形态、颜色等自然状态。将涂有5%冰醋酸的湿润棉球涂到宫颈上，停留120 s以后取掉棉球，肉眼直接观察宫颈颜色变化，宫颈转化区类型、醋白反应、有无镶嵌、有无点状血管和异型血管等病变。鳞柱交界区可见、部分可见、不可见分别对应Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型转化区（TZ1、TZ2、TZ3）。用活检钳在阴道镜下提示可疑病变区域取活检，如TZ3者以刮勺进行宫颈管搔刮，取样组织经10%福尔马林固定。宫颈组织固定后立即送至病理科予以制片，采用苏木精伊红染色。由2位病理医生分别进行判读，如结果不一致时由主任病理科医生判读并审核最终报告结果。 三、统计学分析 先用Shapiro-Wilk Test进行正态性检验。符合正态分布的数据用均数±标准差描述，使用 t检验进行统计；不符合正态分布的数据用 M（ Q 1， Q 3）描述，使用χ 2检验方法进行统计。在一致性研究中，医生采样和自采样的PAX1和JAM3双基因甲基化检测结果ΔCt间的一致性采用Spearman相关性分析法检验，并画出Bland-Altman图。PAX1 m/JAM3 m、PAX1 m、JAM3 m医生采样和自采样的一致性用Kappa值表示，差异性用配对χ 2检验。在验证研究中，计算不同检测方法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值及95% Wald Score可信区间。双侧检验 P 结果 一、基本信息 一致性研究组自采样的sΔCtPAX1 m和sΔCtJAM3 m值与验证研究组比较，差异均无统计学意义（ P均0.05）。2组基本特征与检测结果见 表1 。 二、自采样本与医生采样本进行PAX1和JAM3 双基因甲基化检测结果的一致性分析 Spearman相关性分析显示，自采和医生采的PAX1和JAM3双基因甲基化测试的 r值分别为0.858（ P0.05）。一致性研究中，全部样本（81份）PAX1 m/JAM3 m检测的Kappa=0.90， P\=0.134；m/JAM3 m检测的Kappa=0.72， P\=0.479；CIN2+样本（40例）PAX1 m/JAM3 m检测的Kappa=0.84， P\=0.065，提示了结果的高度一致性（ 表2 ）。 图1 PAX1和JAM3甲基化测试Bland-Altman图 三、PAX1与JAM3双基因甲基化检测结果与其他检测结果的相关性分析 临床研究纳入191例受试者，以组织病理学检测结果作为金标准比较自采样本检测双基因甲基化与HPV及细胞学检测方法的临床检测效能，结果见 表3 。CIN2+为阳性结果显示 PAX1 m/JAM3 m的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为77.6%（95% CI 65.3%~86.4%）、87.2%（95% CI 80.5%~91.9%）、72.6%（95% CI 60.4%~82.1%）和89.9%（95% CI 83.5%~94.0%）。使用单变量分析和赤池信息准则来构建逻辑回归模型。模型包括sPAX1 m、sJAM3 m和液基细胞学检测ASCUS（liquid based cytology ASCUS，LBCasc-us）3个变量，我们评估了每个单独变量、组合，以及整体模型的预测能力。PAX1 m/JAM3 m 联合HPV16/18检测或hrHPV检测的敏感度等于HPV 16/18，高于其他检测，为89.7%（95% CI 79.2%~95.2%）；PAX1基因、JAM3基因、PAX1/JAM3双基因甲基化检测的特异度分别为93.2%（95% CI 87.6%~96.4%）、89.5%（95% CI 83.1%~93.6%）与87.2%（95% CI 80.5%~91.9%），甲基化单独或联合检测的特异度与阳性预测值皆高于hrHPV、HPV16/18与细胞学，差异有统计学意义（ P0.05）。 对于CIN3+病变的检测结果显示PAX1 m/JAM3 m联合HPV16/18检测的敏感度最高为96.0%（95% CI 80.4%~99.3%），特异度前3名为PAX1 m（80.7%）、LBC（LSIL+）（78.4%）和PAX1 m/JAM3 m（75.9%）。不同检测方法比较时，JAM3 m 36.2%（95% CI 25.0%~49.1%）显示了最高阳性预测值，PAX1 m/JAM3 m［97.7%（95% CI 93.4%~99.2%）］为最高阴性预测值。 自采样本中检测PAX1或JAM3双基因甲基化ΔCP值在不同宫颈病变程度样本中的分布见 表4 ，PAX1 m或JAM3 m检测值在病理CIN2与正常组间差异有统计学意义（ P0.05）。 四、绝经与未绝经女性自采样本进行PAX1与JAM3双基因甲基化检测的效应分析（临床研究） 在临床研究中病理CIN2+PAX1 m/JAM3 m的敏感度与特异度分别为77.6%（95% CI 65.3%~86.4%）、87.2%（95% CI 80.5%~91.9%）。绝经前女性甲基化检测特异度为PAX1 m 96.1%（95% CI 90.3%~98.5%）、JAM3 m 92.2%（95% CI 85.3%~96.0%）与PAX1 m/JAM3 m 92.2%（95% CI 85.3%~96.0%）。PAX1 m/JAM3 m在绝经后女性检测敏感度与阴性预测值为94.7%（95% CI 75.4%~99.1%）和95.7%（95% CI 79.0%~99.2%），见 表5 。 讨论 宫颈自采样进行分子检测可以将不易参加常规细胞学筛查的女性纳入子宫颈癌筛查计划 ［  9 ， 15 , 16 , 17 ］ 。世界卫生组织发布《WHO宫颈癌前病变筛查和治疗指南（2版）》 ［  9 ］ 指出自采样进行HPV-DNA检测作为宫颈癌初筛方案并提示甲基化检测在未来宫颈癌筛查中应用具有可行性。在自采样的情况下，有效细胞的刷取效率下降会产生样本质量差异，因此需进行自采样样本和医生采样本检测结果的一致性评估研究。本研究结果说明自采样本进行PAX1与JAM3双基因甲基化检测较医生采样的阳性率（42.0%比46.9%）与敏感度（77.5%比82.5%）略低而特异度（92.7%比87.8%）较高，且阳性率均随病变严重度而增加，2种采样方法结果具有一致性，且能够准确地识别子宫颈病理HSIL与子宫颈癌，支持了自采样作为PAX1与JAM3双基因甲基化检测的临床应用的可行性。 高敏感度的hrHPV-DNA检测是目前许多国家宫颈癌首选的筛查方案，然而其特异性较低，使其可能无法区分持续性和暂时性感染 ［  18 ］ 。荷兰HPV筛查计划研究表明使用DNA