阴道微生态影响宫颈细胞DNA甲基化水平与宫颈病变的相关性研究

方法 横断面研究。共纳入2022年4月至2024年8月在中南大学湘雅三医院就诊的女性患者492例，根据检查结果将研究对象分为4组：人乳头瘤病毒（HPV）/薄层液基细胞学检测（TCT）阴性组81例、慢性炎组236例、低度鳞状上皮内病变（LSIL）组117例、高度鳞状上皮内病变（HSIL）组58例。收集患者一般信息、阴道微生态检测、HPV、TCT、阴道镜及宫颈活检病理结果，收集阴道分泌物标本进行阴道微生物群定性检测，收集宫颈脱落细胞标本进行PAX1、JAM3甲基化检测。采用单因素方差分析比较各组阴道微生态及甲基化差异，多元有序Logistic回归分析微生态指标、PAX1及JAM3甲基化水平与宫颈病变相关性，多元线性回归分析阴道微生态指标与PAX1、JAM3甲基化相关性，中介效应分析三者关系

结果 在各组间阴道微生态指标中，菌群密集度、菌群多样性、Nugent评分、pH值、优势菌、白细胞酯酶差异、惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌差异有统计学意义（ P均［&nbsp; 1 ］&nbsp; ，其癌前病变分为低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）与高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL） ［&nbsp; 2 ］&nbsp; ，早期识别干预对降低其发病率和死亡率意义重大。高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）感染是宫颈癌发生的核心诱因 ［&nbsp; 3 ］&nbsp; ，而阴道微生物群在人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染引起的宫颈病变进展中可能发挥重要作用 ［&nbsp; 4 , 5 , 6 , 7 ］&nbsp; 。健康的阴道微生物环境以乳杆菌为主要优势菌群，其通过多种机制以抵抗致病性感染 ［&nbsp; 8 , 9 ］&nbsp; 。阴道微生物生态环境的失衡与HPV感染及宫颈病变的发生密切相关 ［&nbsp; 10 , 11 , 12 , 13 , 14 ］&nbsp; ，但具体作用机制仍不明确。 在表观遗传学层面，癌细胞存在整体DNA低甲基化与特定肿瘤抑癌基因启动子高甲基化的特征 ［&nbsp; 15 ］&nbsp; 。数据表明配对盒基因1（paired box 1，PAX1）高甲基化与宫颈上皮内瘤变3级及以上病变（cervical intraepithelial neoplasia Ⅲ+，CIN Ⅲ+）的发生风险呈正相关，可作为早期宫颈癌标志并预测病变进展 ［&nbsp; 16 , 17 , 18 ］&nbsp; 。连接黏附分子3（junction adhesion molecule 3，JAM3）属于免疫球蛋白超家族成员，参与白细胞迁移、血管生成和肿瘤转移等种生理病理过程 ［&nbsp; 19 ］&nbsp; 。多中心临床研究表明宫颈脱落细胞中PAX1/JAM3双基因甲基化检测在诊断高级别宫颈癌前病变具有较高准确度和特异性，这一新型检测方法有望替代传统细胞学成为HR-HPV阳性女性的分层管理方案 ［&nbsp; 20 ］&nbsp; 。 本研究基于PAX1和JAM3，在分析阴道微生态、DNA甲基化与宫颈病变的相关性的基础上，进一步探讨阴道微生态与DNA甲基化可能的相关性及其在宫颈病变发展中的作用，以期为宫颈癌的早期防治提供理论依据。 对象与方法 一、对象 选取2022年4月至2024年8月在中南大学湘雅三医院就诊并完成宫颈癌筛查的女性为研究对象，共492例患者入组并分为以下4组。 （1）HPV/液基薄层细胞学检测（thinprep cytologic test，TCT）阴性组（HPV、TCT均阴性）：81例，年龄40.0（33.5，48.5）岁；（2）慢性炎组（HR-HPV阳性，宫颈活检病理结果为慢性宫颈炎）：236例，年龄37.0（30.0，49.0）岁；（3）LSIL组（HR-HPV阳性且宫颈活检病理结果为LSIL）：117例，年龄40.0（30.0，51.0）岁；（4）HSIL组（HR-HPV阳性且宫颈活检病理结果为HSIL）：58例，年龄39.0（33.0，46.0）岁。 本研究已通过中南大学湘雅三医院伦理委员会审批（快24789），研究对象均签署知情同意书。 二、方法 1.试剂与仪器：人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒购自湖南圣湘生物科技股份有限公司，阴道炎联合检测试剂盒购自湖南友哲科技有限公司，阴道炎多重病原体核酸联合检测试剂盒、核酸提取或纯化试剂、甲基化检测样本前处理试剂盒及人PAX1和JAM3基因甲基化检测试剂盒均购自北京起源聚禾生物科技有限公司。主要使用的仪器为CX23型显微镜（日本OLYMPUS公司）和SLAN-96S型全自动医用PCR分析系统（上海宏石医疗科技有限公司）。 2.基本信息：采集患者和宫颈病变相关的一般情况信息、临床资料，包括年龄、体重指数（body mass index，BMI）、孕次、产次、绝经状况。 3\. TCT检测：由医师通过TCT检测专用的宫颈采样刷采集，样本经混匀、制片、细胞固定及巴氏染色后，由资深病理医师在显微镜下观察，根据2014年世界卫生组织宫颈癌前病变二级分类法出具诊断报告。诊断结果分为未见上皮内病变细胞或恶性细胞、其他（45岁女性的子宫内膜细胞）、不典型鳞状细胞（分为未明确诊断意义的不典型鳞状细胞、不能排除高级别鳞状上皮内病变的不典型鳞状细胞）、LSIL、HSIL、鳞状细胞癌、不典型腺细胞、原位腺癌和腺癌。 4\. HPV检测：用HPV检测专用采样刷置于宫颈口同一时针方向柔和转动5周取样，取出后将采样刷置于样本收集管中标记送检。本研究采用通过特异性引物及荧光探针技术结合PCR检测23种HPV型别（HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、42、43、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、81和82），严格按照试剂盒说明书操作并进行结果判读。其中16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型为世界卫生组织明确确认是高危型别。 5.阴道微生态检测：由资深检验医师进行阴道微生态检测，包括形态学及功能学的评估。形态学检测过程为阴道分泌物进行涂片、固定及革兰染色，于显微镜油镜下观察，检测指标包括：清洁度、菌群密集度、菌群多样性、优势菌、病原微生物和Nugent评分。功能学测定严格按照说明书进行操作和判读，检测指标包括：pH值、过氧化氢、白细胞酯酶、唾液酸苷酶、β葡萄糖醛酸酶和乙酰氨基葡萄糖苷酶。所有阴道微生态形态学和功能学检测标准参照2016年中华医学会妇产科学分会制定的《阴道微生态评价的临床应用专家共识》 ［&nbsp; 21 ］&nbsp; 执行。 6.阴道微生物群检测：采用荧光PCR熔解曲线法对女性阴道分泌物中的9种微生物进行定性检测，包括卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌、加德纳菌、阿托波菌、普雷沃菌、念珠菌和阴道毛滴虫。通过测定每种病原体在各自荧光通道的熔解温度（melting temperature，Tm）值判断病原体的类型，对应关系如下：FAM 51~56 ℃为阴道毛滴虫，59~64 ℃为阿托波菌，69~74 ℃为惰性乳杆菌，ROX 51~56 ℃为詹氏乳杆菌，59~64 ℃为卷曲乳杆菌，68~73 ℃为加德纳菌，76~81 ℃为加式乳杆菌，HEX 56~61 ℃为念珠菌，70~75 ℃为内标，CY5 67~73 ℃为普雷沃菌。 7\. DNA甲基化检测：经TCT检测后的剩余样本中，取适量余液进行DNA甲基化检测。通过DNA纯化试剂盒提取后的DNA进行亚硫酸氢盐转化，并用人PAX1和JAM3甲基化检测试剂盒进行PAX1和JAM3甲基化水平检测，PCR扩增程序设置为预变性96 ℃ 10 min，循环1次；变性94 ℃ 15 s；退火64 ℃ 5 s；延伸、荧光采集60 ℃ 30 s；共循环45个周期。PCR仪分析处理系统得到靶基因与内参基因的循环阈值（cycle threshold，Ct）。ΔCtP和ΔCtJ分别为PAX1及JAM3与内参基因Ct的差值，ΔCt值越低提示目标基因甲基化程度越高。 三、统计学分析 采用SPSS Statistics 27进行统计分析。正态分布的计量资料采用表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较使用LSD检验。非正态分布的计量资料采用 M（ Q 1， Q 3）表示，组间比较采用秩和检验，进一步两两比较使用Kruskal-Wallis秩和检验。计数资料以例数（%）表示，组间比较采用Pearson χ 2检验。采用有序多元Logistic回归分析微生态指标、ΔCtP、ΔCtJ与宫颈病变的相关性。采用线性回归分析微生态指标与ΔCtP和ΔCtJ之间的相关性。应用SPSS Statistics 27统计软件的Process 4.1插件构建结构方程模型，使用Bootstrap法重复抽样次数为5000次检验中介效应，采用反对数变换将中介效应转换为对应比值比（odds ratio， OR）值大小。中介效应Boot可信区间不包含0，提示中介效应有统计学意义。双侧 P0.05）。孕次在慢性炎组与HSIL组间差异有统计学意义（ P0.05）。除HPV/TCT阴性组外，其余3组均为HR-HPV阳性，且3组间HPV感染情况差异有统计学意义（ P<0.05），HSIL组的HPV16/18阳性率高于慢性炎组及LSIL组，其他高危型阳性率差异无统计学意义，见 表1 。