DNA甲基化检测在育龄期异常子宫出血女性子宫内膜癌诊断中的应用价值

方法 选取2021年11月至2022年10月就诊于中南大学湘雅三医院妇科异常子宫出血的育龄期、有宫腔镜检查手术指征的女性517例进行前瞻性研究，术前收集宫颈脱落细胞进行细胞学、人类乳头瘤病毒（HPV）和DNA甲基化检测。同时收集患者基本临床信息、生物标记物与经阴道超声（TVS）子宫内膜厚度等信息。以宫腔镜下内膜组织病理学诊断为金标准，采用单因素Logistic回归分析子宫内膜癌的高危因素，利用受试者工作特征曲线下面积（AUC）分析DNA甲基化检测对育龄期女性子宫内膜癌的检测效能

结果 年龄、体重指数（BMI）≥25 kg/m2、内膜厚度≥11 mm、CDO1mΔCt≤8.4、CELF4mΔCt≤8.8、双基因甲基化与年轻女性子宫内膜癌的发生相关，OR值（95%CI）分别为1.16（1.08~1.25）、4.33（1.89~10.31）、9.49（3.88~26.69）、69.62（25.70~224.36）、23.64（9.66~63.99）、87.39（24.83~555.05），均P 对象与方法 一、对象 选取2021年11月至2022年10月就诊于中南大学湘雅三医院妇产科、有宫腔镜检查手术指征行宫腔镜检查的异常子宫出血育龄期女性作为研究对象进行前瞻性研究。入组标准：年龄大于18周岁，基于国内指南［14］，根据临床表现和检查考虑为异常子宫出血，阴道异常排液；根据国内专家建议怀疑内膜病变或由临床医师建议进行宫腔镜检查及活检［8］；既往未因内膜病变接受过任何治疗或手术治疗；愿意接受检测并签署知情同意书；宫腔镜前评估未发现浸润性宫颈癌。接受检测前患者均签署相关知情同意书。根据本研究的入组流程，最终共有517患者满足入组条件并纳入最终的统计分析，根据病理结果将517例患者分为子宫内膜癌组（24例）和对照组（493例），其中对照组包含良性484例和不典型增生9例。 宫颈脱落细胞学的样本来自患者术前进行传统细胞学检查和/或高危人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）检测的剩余样本总计2 ml。患者的宫腔镜检查由中南大学湘雅三医院医院具有资质的术者在静脉麻醉下完成，根据病情对内膜及病变进行活检、切除或诊断性刮宫。患者宫颈细胞学和HPV检测以及组织病理评估由研究者完成并进行复核。本研究通过本院伦理委员会审批，批号：中南大学湘雅三医院（批号22246）。 二、方法 1.试剂与仪器：HPV分型检测试剂盒（广东凯普生物科技股份有限公司）用于HPV DNA基因分型检测。DNA甲基化检测按照“人半胱氨酸双加氧酶1型（cysteine dioxygenase type 1，CDO1）和CUGBP Elav样家族成员4（CUGBP Elav-like family member 4，CELF4）基因甲基化检测试剂盒（PCR-荧光探针法）”（北京起源聚禾生物科技有限公司）产品说明书进行操作［15］。使用SLAN-96S全自动医用PCR分析系统进行PCR反应（上海宏石医疗科技有限公司）。 2\. 研究方法：患者与子宫内膜癌发病相关的一般情况和临床表现由专门的病例收集表采集。本研究重点关注与子宫内膜癌相关的临床指标与检查结果，包含年龄、既往病史、体重指数（body mass index，BMI）、宫颈脱落细胞学检测，高危HPV检测，宫腔镜前1个月内经TVS评估内膜厚度以及宫腔镜前1个月内的糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125），糖类抗原199（carbohydrate antigen 199，CA199）。在本研究中，定义BMI≥25 kg/m2，TVS评估的内膜厚度≥11 mm，CA125≥35 U/ml，CA199≥35 U/ml为异常。根据指南定义异常子宫出血［5］。 3.宫颈脱落细胞学检测：液基细胞学（thinprep papanicolaou test and imaging system manual，LBC）用于宫颈细胞学检测。HPV和新柏液基细胞学检测（thinprep cytologic test，TCT）取样前先用棉签擦去宫颈分泌物，宫颈不进行醋酸及碘液涂抹。将专用的TCT细胞采集刷放置于宫颈管内，逆时针或顺时针旋转5~6周，将细胞采集刷放入专用的小瓶中保存送检。宫颈细胞学描述性（the Bethesda system，TBS）诊断报告结果如下：无上皮内病变或恶性改变，包括正常和炎症；鳞状细胞异常，包括不典型鳞状细胞（atypical squamous epithelial cells，ASC），鳞状上皮内病变（squamous intraepithelial lesion，SIL）和鳞状细胞癌；腺细胞异常，包括不典型腺细胞（atypical glandular cells，AGC）和腺癌。不典型鳞状细胞包括不能明确意义的不典型鳞状细胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）和不能除外高度鳞状上皮内病变的不典型鳞状细胞；SIL包括低度鳞状上皮内病变和高度鳞状上皮内病变。对于所有细胞学结果，最差结果被定义为每例的最终结果。 4.高危HPV DNA基因分型试验：用专用的HPV检测采样棉签置于宫颈口内停留1 min，将采样棉签放入专用试管中保存送检，于4 ℃保存，在24~48 h内进行检测。这21种HPV基因分型试验包括14种高危HPV基因型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68）、6种低风险HPV基因（HPV 6、11、42、43、44和81）和1种疑似高危HPV型（HPV 53）。 5.细胞学甲基化检测及判断：实验样本均为参与者进行宫颈癌筛查后残留的宫颈细胞学样本2 ml。在获得患者知情同意的情况下，进行样本采集。细胞离心分离后利用细胞DNA提取试剂盒进行宫颈脱落细胞DNA提取，利用DNA重亚硫酸盐转化试剂盒处理提取后的核酸，转化完成的DNA（Bis-DNA）立即进行PCR检测。反应结束后根据CDO1基因、CELF4基因与内参基因的Ct值，计算ΔCt（ΔCt=Ct检测基因-Ct内参基因），甲基化判断标准阳性采用约登指数计算方案，判定CDO1mΔCt≤8.4，CDLF4mΔCt≤8.8为阳性。 6.统计学分析：采用SPSS 26.0统计软件包进行统计分析。符合正态分布的计量资料用表示，多组间的差异采用方差分析。非正态分布的计量资料用M（Q1，Q3）表示，两组间的差异采用Mann-Whitney U检验。使用Fisher确切概率法或两个率或两个构成比比较的χ2检验比较不同组患者临床表现的构成比差异。单因素Logistic回归分析用于分析子宫内膜癌发生的相关因素。利用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）下的曲线下面积（area under curve，AUC）评估各指标诊断子宫内膜癌的效果，并计算敏感度、特异度、阳性预测值（positive predictive value，PPV）、阴性预测值（negative predictive value，NPV）、比值比（odd ratios，OR）及95%可信区间（co